产品名称/贷号/CAS：KKX-17057R

英文名称：Human NAD-dependent deacetylase sirtuin-3/SIRT3 kit

检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被（P CREB）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。用底物TMB显色，TMB在化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的谷氨酸（P CREB）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值）。

样品收集、处理及保存方法

1. 血清

   • 使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激。
   • 收集血液后，3000转/分离心10分钟，将血清和红细胞迅速小心地分离。

2. 血浆

   • EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
   • 3000转/分离心30分钟取上清。

3. 细胞上清液

   • 3000转/分离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4. 组织匀浆

   • 将组织加入适量生理盐水捣碎。
   • 3000转/分离心10分钟取上清。

5. 保存

   • 如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20°C，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

1. 酶标仪（450nm）
2. 高精度加样器及枪头：0.5-10μL、2-20μL、20-200μL、200-1000μL
3. 37°C恒温箱

操作注意事项

1. 保存与平衡

   • 试剂盒应保存在2-8°C，使用前需在室温下平衡20分钟。
   • 从冰箱取出的浓缩洗涤液可能会有结晶，这属于正常现象，可通过水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2. 板条保存

   • 实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3. 标准品与样本稀释

   • 浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或空白。
   • 按照说明书操作时，样本已经稀释5倍，最终结果需乘以5才是样本的实际浓度。

4. 严格按照操作时间与顺序

   • 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5. 充分摇匀液体组分

   • 所有液体组分使用前应充分摇匀。

试剂盒组成

试剂的准备

• 20×洗涤缓冲液的稀释
  • 蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法

1. 手工洗板

   • 甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1分钟，甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。

2. 自动洗板机

   • 每孔注入洗液350μL，浸泡1分钟，洗板5次。

操作步骤

1. 从室温平衡20分钟后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4°C。
2. 设置标准品孔和样本孔
   • 标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
   • 样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。
3. 加入检测抗体
   • 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37°C水浴锅或恒温箱温育60分钟。
4. 洗涤
   • 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
5. 加入底物
   • 每孔加入底物A、B各50μL，37°C避光孵育15分钟。
6. 终止反应
   • 每孔加入终止液50μL，15分钟内在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

• 绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

试剂盒性能

1. 准确性

   • 标准品线性回归与预期浓度相关系数 ( R ) 值大于等于0.9900。

2. 灵敏度

   • 检测浓度小于1.0 mg/L。

3. 特

   • 不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性

   • 板内、板间变异系数均小于15%。

5. 贮藏

   • 2-8°C，避光防潮保存。

6. 有效期

   • 6个月

免责声明

1. 试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。
2. 严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。